大鼠Ⅰ型膠原C端肽（CTX-Ⅰ）酶聯免疫分析試劑盒使用說明書

    大鼠Ⅰ型膠原C端肽（CTX-Ⅰ）酶聯免疫分析試劑盒使用說明書

    BS-3640   大鼠Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)ELISA試劑盒96T/48T

    本試劑盒僅供研究使用。

    檢測范圍：96T

    0.156ng/mL-10ng/mL

    使用目的：

    本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿及相關液體樣本中Ⅰ型膠原C端肽（CTX-Ⅰ）含量。

    實驗原理

    本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠Ⅰ型膠原C端肽（CTX-Ⅰ）水平。用純化的大鼠Ⅰ型膠原C端肽（CTX-Ⅰ）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Ⅰ型膠原C端肽（CTX-Ⅰ），再與HRP標記的Ⅰ型膠原C端肽（CTX-Ⅰ）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Ⅰ型膠原C端肽（CTX-Ⅰ）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠Ⅰ型膠原C端肽（CTX-Ⅰ）濃度。

    試劑盒組成

    樣本處理及要求：

    1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。

    2.血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

    3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

    4.細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

    5.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

    6.標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

    7.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

    操作步驟：

    1、標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

    10ng/mL

    5號標準品

    150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液

    5ng/mL

    4號標準品

    150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液

    2.5ng/mL

    3號標準品

    150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液

    1.25ng/mL

    2號標準品

    150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液

    0.625ng/mL

    1號標準品

    150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液

    2、加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

    3、溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

    4、配液：將30倍（48T的20倍）濃縮洗滌液用蒸餾水30倍（48T的20倍）稀釋后備用

    5、洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

    6、加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

    7、溫育：操作同3。

    8、洗滌：操作同5。

    9、顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

    10、終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

    11、測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

    計算：

    以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，

    在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD

    值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋

    倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標

    準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值

    代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋

    倍數，即為樣品的實際濃度。

    注意事項

    1．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

    2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

    3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

    4．請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數（×n×5）。

    5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

    6．底物請避光保存。

    7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

    8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

    9．本試劑不同批號組分不得混用。

    保存條件及有效期:

    1．試劑盒保存：2-8℃

    2．有效期：6個月

    試劑盒性能：

    1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990以上。

    2.批內與批間應分別小于9%和11%

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